共价药物包含反应性官能团，能与蛋白质靶点形成共价键，从而在药物结合过程中赋予除非共价相互作用外的额外亲和力，其用于治疗疾病已有一个多世纪，但促进共价药物合理设计的工具才出现不久。2022年8月25日，UC Berkeley的Lydia Boike等人在Nature Reviews Drug Discovery 上发表了题为“Advances in covalent drug discovery”的综述文章，总结了共价药物发现过程中的里程碑，并着重讨论了从中吸取的经验教训，以及不断发展的共价药物发现工具如何促进该领域的成功。 ——共价药物的历史——

历史上许多共价药物都是在其广泛使用后才被发现是通过共价机制发挥作用的，其中最著名的是非甾体抗炎药（NSAID）阿司匹林（Aspirin）。阿司匹林自1899年开始上市，其作用机制直到1971年才被发现，当时人们发现它通过乙酰化环氧合酶1的底物结合通道中的Ser529来发挥抗炎作用，阻止底物花生四烯转化为前列腺素。早期的共价药物往往来源于天然产物或其衍生物。由青霉属真菌产生的β-内酰胺类抗生素如青霉素（Penicillin）可与参与细菌细胞壁合成的青霉素结合蛋白（PBP）结合。所有PBP都含有活性位点丝氨酸残基，可被青霉素酰化，抑制PBP活性并导致细胞膜破裂。另外一些共价药物是含硫醇代谢物的前药，可形成二硫键以使其靶标失活，1988年获得FDA批准用于治疗胃食管反流病的质子泵抑制剂奥美拉唑（Omeprazole）就是一个例子。共价药物在癌症治疗中也具有历史意义，如硼替佐米（Bortezomib）可共价结合并抑制26S蛋白酶体的催化苏氨酸残基，于2003年被FDA批准用于治疗多发性骨髓瘤患者。过去发现的共价药物已被用于治疗多种疾病，但研究者们更应该从开发初始阶段就关注药物的共价性，而不是事后发现共价作用机制，从而为改进药物设计提供更多机会。

图1. 主要共价药物的开发时间表。每种共价药物根据其治疗的药物类型或疾病类型进行分类。除非另有说明，日期指的是FDA首次批准的时间。 ——共价药物发现方法及案例——

一、配体优先（Ligand-first）方法****

靶向共价抑制剂通常是通过结构引导设计发现的，即通过将亲电官能团掺入已知的可逆配体中以增强对蛋白质功能的抑制，这类方法的一个典型例子是受体酪氨酸激酶EGFR的共价抑制剂。第一代可逆的EGFR抑制剂Erlotinib和Gefitinib（图2a）对发生EGFR 19号外显子缺失或L858R点突变的肿瘤有效，但患者不久就会出现耐药。其中超过一半的耐药是由于EGFR的ATP结合位点发生了T790M突变，该突变不仅降低了可逆抑制剂对EGFR的结合亲和力，而且增加了EGFR对ATP的结合亲和力。为了克服这个问题，研究者策略性地设计了带有丙烯酰胺Michael受体的第二代共价抑制剂（图2b），以与EGFR的半胱氨酸残基（Cys797）反应。Cys797位于ATP结合位点附近，抑制剂与EGFR的不可逆结合部分恢复了针对T790M突变体的活性，并提供了对EGFR信号传导的长期抑制。Afatinib于2013被FDA批准用于EGFR激活突变的转移性NSCLC患者的一线治疗。尽管共价结合使得Afatinib对EGFR T790M突变体的效力增强，但其对野生型EGFR也有很高活性，由此引起的剂量限制性毒性可能会阻止Afatinib提高总体存活率。第三代EGFR抑制剂紧随Afatinib之后，这些共价抑制剂包括WZ4002、Osimertinib和Rociletinib，它们选择性靶向T790M突变体而非野生型EGFR。第三代抑制剂保留丙烯酰胺基团以共价结合Cys797，但将第一代和第二代的喹唑啉部分改为嘧啶以促进对突变体EGFR（T790M）的选择性。Osimertinib于2015年获得FDA加速批准作为NSCLC的二线治疗药物，并于2018年被批准作为转移性NSCLC的一线治疗药物。共价EGFR抑制剂的研发过程成功验证了共价结合邻近激酶活性位点的非催化、非保守半胱氨酸以增加效力并调节初始可逆配体药效性质的方法。这些药物的开发表明，丙烯酰胺亲电试剂具有足够的反应性，能与ATP结合位点附近的半胱氨酸结合，但不至于诱导半抗原化和不良免疫反应。

图2. 三代EGFR抑制剂结构的演变。

**二、亲电优先（Electrophile-first）**方法

“亲电优先”是另一种越来越普遍的配体发现方法，这意味着从一开始就找到共价配体，而不是将共价头结合到已知的可逆配体中。此方法的主要例子包括KRAS（G12C）抑制剂。共价KRAS（G12C）抑制剂的开发是共价药物最令人兴奋的临床发现故事之一。KRAS是一种编码GTPase的癌基因，在大约25%的癌症中发生突变。自从30年前发现KRAS在癌症中的作用以来，直接使用传统药物发现方法对其进行药物治疗的尝试均未成功。KRAS没有用于可逆抑制剂结合的口袋，竞争性抑制剂需要克服GTP和GDP的皮摩尔结合亲和力，而对野生型KRAS有活性的抑制剂可能显示出靶向毒性。 2013年，UCSF的研究人员报告了第一个突变选择性共价KRAS（G12C）抑制剂。该抑制剂是通过一种称为tethering的二硫片段筛选方法发现的，研究者使用完整蛋白质质谱（MS）针对KRAS（G12C）筛选了包含480个二硫片段的文库。KRAS（G12C）的共晶结构表明，命中化合物与SwitchⅡ区结合。随后将二硫化物部分替换为丙烯酰胺和乙烯基磺酰胺亲电体，产生了一些具有体外活性的KRAS（G12C）抑制剂，在此基础上进行了代谢稳定性、生物利用度等方面的结构优化，最终ARS-1620被确定为第一个适用于体内研究的KRAS（G12C）抑制剂。第一个于2018年进入临床试验的选择性KRAS（G12C）抑制剂Sotorasib（AMG-510）也是通过筛选定制小分子库，基于新发现的未知口袋进行结构设计得到的。在KRAS（G12C）抑制剂之前，在肿瘤学中发现的靶向共价抑制剂大多是使用配体优先方法鉴定的。共价KRAS（G12C）抑制剂的成功验证了共价药物发现的亲电优先方法，并肯定了共价片段筛选技术的重要性。 **

图3. KRAS（G12C）与其共价抑制剂Sotorasib和Adagrasib的共晶结构。 ——共价药物发现工具——

共价药物发现所依赖的新兴技术包括完整蛋白质质谱、共价DNA编码文库、共价对接、基于活性的蛋白质分析（ABPP）以及基于化学蛋白质组学的方法等等。 Intact protein MS

基于质谱的化合物筛选方法源于“tethering”技术（2000年发明），即通过给化合物文库中的分子加上二硫键结构来筛选确定能与半胱氨酸邻近口袋结合的片段。命中化合物可与半胱氨酸进行二硫键交换与蛋白质形成加合物，蛋白质分子量增加，从而可通过蛋白质质谱技术识别出来。该策略最初旨在识别出具有挑战性靶标的可逆配体，但后来可以用丙烯酰胺等亲电子试剂代替二硫键来维持共价结合，最早的KRAS（G12C）抑制剂即是通过该策略发现。该方法也被用于发现能调节PPI的分子。 Covalent DNA-encoded libraries****

DNA编码文库（DELs）对文库中的每个分子用特异性的DNA链进行标记并与组合化学方法融合。与基于MS的方法不同，DEL对于共价化合物筛选没有特殊优势，但DEL允许通过固定化、富集、扩增和测序来筛选规模更大的共价文库。实际工作时还必须考虑富集流程和化合物稳定性的影响。 共价对接（Covalent docking）

共价对接可用于虚拟筛选减少实验耗材并可以给出蛋白质配体的结合模式，不同对接程序的原理和效果也各有千秋。比如共价对接平台GOLD在配体和相应氨基酸位点之间预定义键的约束下直接生成结合构象；DOCKovalent使用非共价对接方法预先生成虚拟库的构象和状态，然后在每个状态对共价头部分进行采样；AutoDock将共价配体视为氨基酸侧链，并使用基于物理的评估函数对该柔性侧链的构象进行评分；CovDock使用传统的非共价对接方法将配体对接到蛋白质靶标，然后模拟共价键连接并细化复合物结构。更多和更详细的共价对接方法对比可查看2018年JCIM的一篇文章“Comparative evaluation of covalent docking tools”。 化学蛋白质组学平台（Chemoproteomic platforms）

化学蛋白质组学平台能够直接在复杂的生物系统中识别靶蛋白上的共价化合物及其可配位点，其进展促进了针对无法成药的疾病靶标的共价配体的发现，并能在整个蛋白组中对共价配体进行选择性分析来确定这些配体的靶标，从而为共价药物发现项目的靶标选择提供早期指导。 ——小结——

1、过去数十年中，EGFR、BTK、KRAS（G12C）和SARS-CoV-2 Mpro等抑制剂的批准代表了共价药物发现的里程碑，展示了共价药物从偶然发现到理性设计的转变。 2、亲电优先的发现策略代表了共价药物发现领域的显著转变。但当已知现有可逆配体结合在半胱氨酸等亲核氨基酸附近时，配体优先策略将继续高度适用于设计针对蛋白质的共价药物。作者预计亲电优先方法会越来越多地被采用，特别是当可逆配体的发现具有挑战性时。 参考文献：