为畲药建立“基因身份证” │《畲药物种DNA条形码鉴定》

畲族，自称“山哈”（意为山里的客人），是我国东南部的一个少数民族，主要分布在闽、浙、赣、粤、黔、皖、湘等省80 多个县（市、区），浙江省丽水市景宁畲族自治县是全国唯一的畲族自治县。

畲医药是畲族民众在长期生产、生活实践中，为适应环境和生存健康要求，积累和探索创造的各种医药经验集成，是祖国医学宝库的一个重要组成部分，也是世界优秀文化遗产的一部分。由于诸多因素的影响，畲医药的传承和流传一直面临种种困难，一度濒临失传。在国家对畲医药等民族医药发展的高度重视下，畲医药的抢救和保护工作在21世纪初以来得到有效开展，“畲族医药”和“畲族医药——痧症疗法”分别被列入浙江省非物质文化遗产名录（2007 年）和国家级非物质文化遗产保护名录（2008 年）。

DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码技术是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别的辅助手段和有效补充。简言之，DNA条形码相当于生物物种的身份证，能准确、快捷地证明它是某个物种。DNA条形码技术就像是人类的一双火眼金睛，一眼就能看到物种的本质。

技术的简便性：易于实现，易于操作，易于构建统一的DNA barcoding序列数据库

鉴定的准确性：DNA barcoding序列可以实现门、纲、科、属、种等不同分类水平物种的鉴定

使用的方便性：任何人可以利用DNA barcoding序列数据库，方便地进行数据比对完成鉴定工作

中药材品种繁多，习用品、代用品及多基原、同名异物、同物异名等现象一直是影响中药安全性、有效性的重要问题。传统的基原、性状、显微和理化鉴定等方法对鉴定者的专业水平和经验依赖性较强，易受主观因素的影响，同时也存在局限性，难以满足实际工作需求。

随着中药材DNA条形码分子鉴定方法研究的深入与普及，国家药典委员会于2012年讨论通过在《中国药典》（2010年版）增补本中列入中药材DNA条形码分子鉴定指导原则，该指导原则已收录至《中国药典》（2015年版）通则中，使中药材DNA条形码鉴定进一步规范化。该指导原则主要内容为以ITS2为主体条形码序列的中药材鉴定方法体系，其中植物类中药材选用ITS2/ITS为主体序列，以叶绿体psbA-trnH为辅助序列，动物类中药材采用COI为主体序列，ITS2为辅助序列。目前DNA条形码鉴定体系已成为药材有效的鉴定工具，从基因层面解决了中药材与混伪品的物种识别问题，创建中药材DNA条形码分子鉴定体系，为中草药建立了“基因身份证”。

畲族没有文字，畲药传承完全依靠口口传承，而畲药药材来源复杂，取材基本以野生为主，导致畲药在种植、加工和临床使用过程中普遍存在药品同名异物、同物异名、鉴定不清、替代混用、以假乱真、以次充好等现象，严重影响畲药的效果与用药安全。但是传统的鉴定方法难以满足需求，为保证畲药用药的安全、有效性和适应现代科学研究的需求，亟待一种简便的现代化畲药鉴定技术。

为解决畲药鉴定混乱的问题，程科军博士带领的畲药研究团队积极开展畲药分子鉴定研究，完成了278种畲药的DNA条形码鉴定，在此基础上编著了《畲药物种DNA条形码鉴定》。该书为畲药建立了独一无二的“基因身份证”，擦亮了畲药物种鉴别的“火眼金睛”。

本书第一章总论主要介绍畲药概况、DNA条形码研究概况、DNA 条形码分子鉴定操作流程和畲药相关研究实例等内容；第二至第四章以重要程度分三章对278个畲药品种进行阐述。具体药材项下的体例及内容说明如下：

畲药基原物种的中文名和拉丁名参考Flora of China、《中国植物志》、《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）等书籍以及“物种2000中国”网站 (China Spicies 2000, http://www.sp2000.org.cn/)，并列出该物种所属的科属情况；各参考出处相关内容有不同描述的，简要列明差异，拉丁名则以Flora of China为准。畲药别名参考《整合畲药学研究》、《浙江丽水药物志》、《中国畲药学》等书籍；基原物种别名参考《中国植物志》、《浙江植物志》、《浙江丽水药物志》、《中国畲药学》等书籍。药材项下提供基原物种形态照片。

【中国药典】列出畲药对应基原物种在《中国药典》中的收录情况，包括《中国药典》中的中药材名称和对应的基原物种及药用部位情况。如该物种未收录于《中国药典》中，则统一注明为“无”。

【植物形态】描述基原物种（植物）的主要形态特征，药材基原为真菌或地衣体时，该栏目分别称为子实体形态或地衣体形态，主要参考《中国植物志》、《浙江植物志》、《中国畲药学》等书籍。

【生态环境】描述基原物种的生态环境，主要参考《中国植物志》、《浙江植物志》、《整合畲药学研究》、《浙江丽水药物志》、《中国畲药学》等书籍。

【功效】和【主治】列出药材的主要功效及主治，主要参考《整合畲药学研究》、《浙江丽水药物志》、《中国畲药学》等书籍。

【DNA提取及序列扩增】本书采用试剂盒法提取畲药基原物种样本的基因组DNA，操作步骤参照试剂盒说明书。对于DNA提取困难的样本，参考《中国药典》（2015年版）收录的“中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”进行调整。PCR扩增体系及条件均参照“中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”中的标准操作流程进行。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后条带单一且明亮的样品进行双向测序。

【ITS2序列特征】测序获得的双向序列使用CondonCodeAligner软件进行序列拼接和质量评价。拼接后的序列在ITS2网站 (http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/) 进行注释，得到相应的完整ITS2序列。ITS2序列数对应采集的植物样本数。运用DNAMAN和GeneTool等生物软件对同一物种的各条ITS2序列进行比对分析，列出序列长度、变异位点及GC含量等序列特征相关信息。“主导单倍型”指该物种所获取的所有序列中占比最大的单倍型序列，以条形码附加二维码的方式展示（见下图）：

上图中左侧的彩色条形码为物种的主导单倍型序列，四种不同颜色竖条表示四种不同碱基(

)。右侧的二维码图片与左侧条形码对应，使用二维码扫描软件可直接获得含物种拉丁名的DNA序列信息。该展示图片通过陈士林课题组创建的网站自动生成。

【ITS2序列二级结构】由ITS2网站(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/) 预测获得ITS2序列二级结构。ITS2序列二级结构由螺旋 (Helix) I、II、III和IV区组成。各物种的ITS2二级结构的差异在于螺旋I、II、III、IV间夹角的不同、长度的差异以及上面茎 (Stem) 环 (Loop) 的数目和形状的不同，由此显示不同物种ITS2的分子形态特征。