JEV：细胞外囊泡未来的路在何方
细胞外囊泡研究领域从上世纪八十年代开始建立到2015年由nature一篇胰腺癌外泌体生物标志物的文章所引爆，到目前已经成为近些年热门的新兴领域之一。随着近些年有关细胞外囊泡的研究报道井喷式的出现，细胞外囊泡领域也经历了野蛮生长时期。随着越来越多的文章开始呼吁大家严谨的开展细胞外囊泡相关的研究，如何建立严谨的、可重现性的细胞外囊泡标准研究方法逐渐成为目前研究领域内最亟待解决的问题。
近期，国际细胞外囊泡协会会刊刊发了协会最新一版调查问卷的统计结果。这次调查问卷的主要内容是汇总大家关于细胞外囊泡形成分泌机制、细胞外囊泡研究方法标准化及细胞外囊泡RNA研究重要性的意见。其中涉及了目前国际细胞外囊泡协会成员们对目前细胞外囊泡领域发展方向和未来动向的相关简介，在这里hzangs做一些浅显的解读，帮助大家了解学者们对这一领域的看法。
国际细胞外囊泡协会在近些年来的年会多多少少都将主题设置的与细胞外囊泡RNA相关，但是目前细胞外囊泡RNA的装载、传递机制、摄取后命运及功能作用方式依旧不是十分清楚。同时考虑到细胞外囊泡不仅携带了RNA，还会携带多种蛋白质、脂质、细胞代谢产物等，这些成分的作用是否值得去研究也是目前未解决的问题。基于这一背景，协会发放了调查问卷。调查问卷包含了10个科学问题（但是hzangs看附录只找到9个问题，声明中表示关于个人信息及关于ISEV的相关问题隐去了，可能10个问题中有一个是关于ISEV的）。
1、你认为目前我们对细胞外囊泡的生命周期的不同阶段的了解情况是怎样的，按照最了解到最不了解的顺序排列。
2、你认为细胞外囊泡的功能主要有什么组分介导。
3、你认为细胞外囊泡中哪一个组分可能包含的潜在生物标志物更多。
4、你认为细胞外囊泡领域内的合作情况如何。
5、细胞外囊泡领域目前如此关注RNA是否合理。
6、在过去的十年里，RNA一直是EV领域的焦点。美国国立卫生研究院决定赞助一个细胞外RNA通信联盟(ERCC)，为期5年。推进细胞外RNA和EV研究的剩余障碍和挑战是什么?需要什么来克服这些障碍和挑战。
7、 细胞外RNA或EV生物学的那些基本方面/机制/特征还有待确定，以便整个领域蓬勃发展。
8、 你希望看到EV领域出现什么标准化的protocol或资源(如果有的话)。
9、 请添加任何关于EV或exRNA科学领域没有被以上问题涵盖的评论。
这份调查问卷被发给了ISEV存有邮箱地址的会员，同时在Facebook和Twitter公布，问卷调查开放了15天。最终回收了192份问卷，其中188份来自不同的IP地址。基于地址数据，这一192分问卷中有51%来自欧洲和非洲（估计绝大部分是欧洲的，hzangs注），美洲占了35%（估计大部分是来自美国，小部分来自加拿大，其余国家可能就凤毛麟角了，hzangs注），亚太地区占了14%（这可能还要包括来自澳大利亚问卷，毕竟澳大利亚有院士是ISEV的委员，hzangs注）。由此可见，这份问卷的结果更多的是反应了欧洲地区细胞外囊泡研究者的观点，同时带有一些美国研究者的观点，而中日韩三国的研究者观点就可能很少了。
关于细胞外囊泡生命周期的不同过程的理解深度。
从问卷的调查结果看，投票排序从最了解到最不了解依次为：
细胞外囊泡的发生（biogenesis）、运输和稳定（transport/stability）、被靶细胞摄取（uptake）、内容物的装载（cargo loading）、功能分子的传递（cargo transfer）。
这是汇总结果，不同的学者对排序存在不同的见解，但细胞外囊泡的发生更多的被放在了第一位，而内容物传递和内容物装载则更多的被放在了最后两位。
读一些综述可以发现，目前关于细胞外囊泡的生物发生过程具有比较清晰和详实的介绍，而关于内容物的分选筛选通常会落脚到ESCRT复合物，传递过程则更加的不清晰。这可能也是目前细胞外囊泡基础研究领域亟待解决的问题。解决这些问题有利于我们更好的解释和利用细胞外囊泡的各种性质。
什么成分介导了细胞外囊泡的功能。那些类型的细胞外囊泡组分可能富含更多的潜在生物标志物。
这两个问题相似，所以放在一起。第一个问题大部分学者选择了蛋白质、核酸以及细胞外囊泡作为一个整体发挥功能，少部分人选择了脂质、细胞外囊泡外部分子以及代谢产物。第二个问题大部分人依旧选择了细胞外囊泡蛋白和核酸。这也反应了目前细胞外囊泡研究领域最为人们接受的研究方向，大家读文章也会发现，目前研究细胞外囊泡RNA及蛋白质的报道相对要更多一些，而细胞外囊泡的脂质分子、外部结合分子以及代谢产物的功能报道却十分少见。这问题其实可能更多的反映了目前人们的认知，逆向思维一下，其实去研究细胞外囊泡的脂质分子、外部结合分子和代谢物的功能能够最大程度的降低文章被抢发的可能性。当然，这些方向也会受到目前不是很完善的研究方法的限制。
细胞外囊泡领域关注RNA是否合理。
这一结果显示目前大部分人认为我们如此关注细胞外囊泡RNA和细胞外RNA是合理的。也可以看到，目前细胞外囊泡相关RNA以及细胞外RNA的研究相比其他成分有更多的报道，另外目前处于研发阶段或已经上市的临床相关产品中细胞外囊泡相关RNA和细胞外RNA的产品也更为常见。但这些也可能是由于目前技术发展不均衡所导致的，应该指出的是，目前核酸的检测和测序技术十分发达和先进，但是对于蛋白、脂质等成分的检测和分析技术还需要长足的发展。
细胞外囊泡在体内与体外的功能和化学计量的确定。
参与调查问卷的学者们还提及了目前细胞外囊泡功能研究的近况。目前有大量体外实验证明细胞外囊泡在大量的生物学过程中发挥功能，这一点表明细胞外囊泡具有明确的功能意义。但是目前的研究方法还存在很多不足之处。大量的体外实验最终要回归到体内实验的环境下来验证其相关功能。如何来确定体内体外实验使用的细胞外囊泡合理剂量也是未来的研究中需要着重考虑的问题。
处理少量甚至单个囊泡单个分子的相关技术。
检测灵敏度问题是目前细胞外囊泡领域面对的主要问题之一，用于分析少量甚至单个囊泡单个分子的技术是目前亟需的。一些学者指出，在目前高灵敏度分析方法不完善的状态下，我们应当注意自己研究的局限性，尽可能的避免对低于检测限的数据进行过度的解读。学者们还再次强调了目前细胞外囊泡异质性的问题，学者们认为精确分析单个细胞外囊泡甚至分析细胞外囊泡上的单个分子是目前细胞外囊泡异质性研究中亟需的技术。Hzangs认为强调检测灵敏性问题还是十分必要的，例如在我们没有精确的定量系统前，我们应该谨慎考虑细胞外囊泡数量差异所影响的表型；在我们依旧没有简便方法得到高纯度细胞外囊泡前，慎重解释“细胞外囊泡”带来的各种表型。
实验逻辑的严谨性和实验结果的重现性。
这次调查问卷中关于实验逻辑的严谨性和实验结果的重现性包括实验方法的标准化是学者们呼吁的重要内容之一。学者们强烈建议针对细胞外囊泡研究的每个阶段包括分离纯化功能研究及生物信息学分析等步骤建立严格的可重现的方法。有学者指出，目前发表的一些关于“细胞外囊泡”的研究报道完全不是细胞外囊泡相关的功能，而是由于使用了不合适的商业化产品和不合适的技术所导致的。Hzangs认为实验的严谨性和数据的重现性是目前科研领域全体学者都要面对的严肃问题，而对于细胞外囊泡领域，这一问题可能需要更加严肃和端正的面对。
新技术和新理解。呼吁更多的合作。
最后学者们还呼吁更加深刻的去理解细胞外囊泡，深入研究其生命周期内不同过程和背后对应的机制，同时应当重视细胞外囊泡研究相关的技术的开发，两者是相辅相成的。另一方面，学者们也呼吁更多的交流和合作机会。
后记：这篇报道写的有点晚了,调查问卷是上周五刊发出来的。
Hzangs阅读后一周内断断续续写了这些。
从调查问卷看，我们应该注意一下几点：
1、目前细胞外囊泡领域研究在国内方兴未艾，大量的研究人员开始关注到细胞外囊泡的生物学意义和临床应用价值。
2、虽然国内有大量的囊泡相关报道，但是目前国内很多研究人员存在蹭热度，“打一枪换一个地方”的可能，研究的持续性和可扩展性不足。
3、从调查问卷被访问的学者仅有14%左右来自亚太可以看出，国内细胞外囊泡领域研究在国际上的话语权仍然不足。这一方面与西欧人比较保守高傲有关，另一方面也是由于国内乃至东亚地区还没有足够多的重量级研究报道。
4、目前细胞外囊泡领域依旧存在诸多问题，最主要的问题集中在实验设计的严谨性、实验结果的可重复性以及囊泡研究相关技术的标准化方面。本质原因是由于目前囊泡相关研究的技术手段不足。未来几年，囊泡研究相关技术的开发会成为领域内关注的重点之一。
5、目前细胞外囊泡领域的研究主要集中在RNA方面，但是多数学者认为细胞外囊泡相关的蛋白、细胞外囊泡相关脂质、细胞外囊泡作为一个整体结构都应该会具有相应的功能。尝试研究它们可能是未来细胞外囊泡基础研究的方向之一。
根据调查问卷的结果，结合hzangs解答大家问题时的一些发现，hzangs在这里提醒大家在实验中可能需要注意一下几个问题：
1、目前细胞外囊泡研究的相关技术依旧不完善。
我们目前依旧不能通过简单的实验操作获得高纯度的细胞外囊泡样品。这就要求我们在追求高质量的论文时一定要进行严谨的实验设计，严格设置各种对照组，避免样品中的杂质带来假阳性结果。当然，如果并不追求高质量的论文，还是可以按照目前的套路继续做下去。
2、目前细胞外囊泡相关的定量检测技术灵敏度还不够。
学者们呼吁不要过度阐释数据。例如目前由于样品纯度不足和定量手段灵敏度不够，这就要求我们谨慎阐释细胞外囊泡数量变化性状。大家在实验中一定要考虑所采用技术的检测分析下限，避免在拿到低于检测下限的数据后进行过度解读而得出错误的假设，这样会严重影响自己的后续实验。
3、JEV杂志已经从去年开始关注不正规的商品化试剂盒对实验数据的影响。
在文章中的措辞也愈发的严格。过去只是说一些商品化的试剂盒可能不适合做某些实验，但现在已经借被访问的学者之口说出了：不正规的商品化试剂盒做出的结果很可能并不是细胞外囊泡的功能，而是杂质带来的假阳性。所以大家还是要在课题设计之初就谨慎并且全方位的评估自己的需求来选择适合自己的细胞外囊泡分离方法。
4、目前细胞外囊泡领域依旧处于一个建立技术系统，推进基础研究进展的阶段。
由于技术的不足和实验方法标准化方案的缺失，很多时候我们的实验是没有标准设计方案的，因此大家不要拘泥于细节，实验方法应当尽可能保证前后一致，而技术细节只要不违背常规的实验逻辑即可。
5、定量问题、功能实验中的细胞外囊泡用量问题目前依旧没有定论，你无论去询问谁，都得不到准确的答案。因此大家在确定用量时还是要根据自己的实验需求并参考类似的论文来确定。
好了，今天就说这么多吧。
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