环吡咯通过阻断衣壳装配抑制乙型肝炎病毒分泌

2019 年 6 月 3 日 中国生物技术网

| 编译：周彩欣，魏韬，郑倩望（华南农业大学食品学院）

慢性乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，以下简称HBV）感染可导致肝硬化和肝细胞癌。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，HBV感染在一类致癌物清单中。感染患者目前接受核苷/核苷酸类似物和干扰素α治疗，这种方法虽有疗效，但是效率低，因此是一个严重的公共卫生问题。

在2019年5月16日《Nature Communications》上发表了一篇名为Ciclopirox inhibits Hepatitis B Virus secretion by blocking capsid assembly的文章。通过筛选了978种FDA批准的化合物，它们能够抑制HBV表达的Hepg2.2.15细胞中的HBV复制，他们发现，环吡咯是一种合成的抗真菌剂，通过阻断乙肝病毒衣壳的装配，可以强烈抑制乙肝病毒在细胞和小鼠中的复制。环吡咯与核苷/核苷酸类似物协同作用，以防止细胞和人源化肝小鼠模型中的HBV复制。

Hepg2.2.15细胞是AYW亚型（D型）HBV复制子稳定整合的细胞。在研究过程中，Junk-Ah Kang等人通过在高通量筛选，将这些细胞暴露于每种化合物的1μm中3天，观察它们对HBV DNA分泌的影响。以1μm恩替卡韦（ETV）处理为对照。用HBV DNA引物和探针装置定量PCR检测HBV DNA分泌，经ETV孵育3天后，HBV DNA颗粒分泌减少42.1±14.1%。在测试化合物中，至少19种与ETV一样有效。然而，由于19种化合物中的一些的抑制效果差异很大（图1a），他们以更长的治疗周期（6天）重复试验。13种化合物稳定地抑制了HBV DNA的分泌（图1b）。然后他们通过定量PCR评估这19种化合物对细胞内HBV转录的抑制程度。四种化合物显著降低了细胞内HBV转录水平（图1c）。最后，分析了这19种化合物对HBV胞内衣壳形成的影响。只有环吡咯抑制乙肝病毒衣壳装配（图1d）。

FDA批准的化合物对HBV复制的影响

总的来说，结果显示环吡咯最有效地抑制了HBV DNA的分泌（图1b），可能是通过抑制HBV衣壳的组装。因此，他们将环吡罗作为一种抗HBV化合物进行了评价。

他们还从环吡咯抑制体外和细胞内乙肝病毒衣壳装配、复合HBV核心蛋白的总体结构、对HBV核心蛋白结合位点的表征、在体外感染模型中抑制HBV复制以及与TDF或ETV联合治疗的效果等方面进行了深入的实验研究。

具体结果如下：

1. 环吡咯体外HBV衣壳组装的半最大抑制浓度（IC50）为445±17 nm，另外，测试验证了环吡咯与抑制HBV衣壳组装相比，破坏组装的HBV衣壳的能力效率较低（27μM）。在细胞内，环吡咯也抑制HBV衣壳装配，IC50为2.9±0.3μm，总变性HBV核心蛋白不受影响，但如果处理时间延长，其总核心蛋白也会减少。因此，环吡咯在体外抑制HBV外壳的正常组装。

2. 环吡咯仅与其他组装调节剂结合的六个位点中的三个结合。其次，除了广泛的疏水相互作用外，Y118还与环吡咯形成必需的氢键和盐桥，将其锚定在结合口袋中。HBV核心蛋白和环吡咯复合体的晶体结构揭示了二聚体-二聚体界面的独特结合模式。

3. 118（Y118F）通过酪氨酸突变为苯丙氨酸来破坏氢键，显着降低了环吡咯介导的对正常HBV衣壳组装的抑制作用。

4. 环吡咯以剂量依赖性方式降低细胞内HBV DNA水平。定量PCR分析显示，环磷酰胺对HepG2.2.15和转染细胞分泌HBV DNA 的IC50值为880±70 nM和750±150 nM。定量PCR分析还显示细胞内HBV DNA 的IC50值分别为800±100 nM和800±180 nM。因此，环吡酮抑制两种细胞系中的HBV DNA产生。同时，环吡酮对HBsAg产生或HBV转录物水平没有影响。简单来说，环吡酮通过抑制HBV衣壳组装来抑制含有病毒DNA的颗粒的分泌，而不是由于细胞毒性或限制HBV转录或HBV蛋白的产生。

5.用环吡酮处理NTCP表达的HepG2和Huh-7细胞后，HBV DNA的分泌，cccDNA水平和细胞内松弛的环状DNA水平显着下降。可知，环吡咯阻断了这些细胞系中的HBV复制，表明它可能对开发新的抗HBV药物有用。

6. 环吡咯可以与已建立的药物如TDF和ETV协同抑制HBV复制。

观察结果表明，环吡咯可与HBV核心蛋白结合如下。首先，在HBV衣壳形成之前或之后，它优先与一半可能的结合囊结合；这导致必要的二次相互作用，并引起亚单位的结构变化。因此，可能形成高度不对称的二聚体，从而导致形成不规则或畸形的HBV衣壳，产生较少的HBV病毒。不幸的是，目前的数据不允许他们确定为什么环吡咯有一个独特的结合位点偏好，或者环吡咯和TDF和ETV如何协同抑制HBV复制。

综上所述，口服环吡咯可通过阻断乙肝病毒衣壳的装配，为治疗慢性乙肝病毒感染提供新的机会。

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