【2018-50期】This Week in Extracellular Vesicles
本周hzangs在最新文献中选取了9篇分享给大家。第1篇是一个重复性研究，这一研究在2016年于elife注册，尝试重复外泌体领域大牛David Lyden在2012年的外泌体相关研究，但是重复结果不是很理想，并没有很好的重复出之前的数据，我们后期会持续关注这一报道；第2篇报道介绍了肺泡灌洗液中的细胞外囊泡存在富含RNA和RNA低含量细胞外囊泡亚群，一定程度上解释了过去研究中认为的细胞外囊泡RNA拷贝数低与细胞外囊泡RNA能够发挥功能之间的矛盾；第3篇是JEV杂志刊发的几个细胞外囊泡领域的概括性知识海报；第4篇文章介绍了一种工业化应用级别的细胞外囊泡分离手段和方法。相关文章的原文在周一前会发布到论坛同名贴下，需要的可以到论坛下载。
1. 特别关注！Replication study: Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET.
再现性研究：黑色素瘤外泌体通过MET驯化骨髓祖细胞向促肿瘤转移表型。
[Elife] IF=7.616 PMID：30526855
摘要：作为再现性项目：癌症生物学的一部分，我们发表了一份注册报告（Lesnik等，2016），该报告描述了我们打算如何重复从“黑色素瘤外泌体驯化骨髓祖细胞通过MET向促转移表型”选定的实验。 '（Peinado等，2012）。在这里，我们发表验证结果。我们使用与原始研究相同的高转移性小鼠黑色素瘤细胞系（B16-F10）稳定表达短发夹RNA以降低Met表达（shMet），其有效地下调了B16F10细胞中的Met，这一点与于原始研究类似。来自对照细胞的外泌体表达Met，shMet细胞的外泌体中Met减少; 然而，我们无法可靠地检测外泌体中的磷酸化的Met。我们测试了外泌体依赖性Met信号传导对原发性肿瘤生长和转移的影响。与原始研究中的结果相似，我们未发现原发肿瘤生长的统计学显着变化。测量肺和股骨转移，我们发现对照细胞外泌体处理相比，转移负荷略有增加。当Met表达降低时这一差异也会减少; 然而，虽然效果与原始研究的方向相同，但它们没有统计学意义。原始研究与此复制尝试之间的差异主要包括：敲低效率水平，细胞系遗传漂移，样本量，研究终点和观察到的转移负荷的变异性等，这些是可能影响结果的因素。最后，我们报告了每个结果的荟萃分析。
PS：Elife一直关注于生物学研究的可重复性。这篇文章是在2016年注册的一个重复性研究。文章重复了David Lyden实验室在2012年发表的关于黑色素瘤外泌体通过Met分子驯化骨髓祖细胞构建转移前微环境的报道。重复结果让人并不满意。结果显示黑色素瘤外泌体确实携带了Met分子，敲低细胞的Met会影响外泌体中Met的水平；但是外泌体Met的磷酸化水平过低无法检测，无法重复，另外携带Met的外泌体并没有明显促进肿瘤的转移。基本上等于宣布了数据无法重复。当然这也可能是由于不同实验室不同体系造成了实验的无法重复。我们可以继续关注后续报道。关于这一重复实验的内容可以参考2016年的推文：【2016-5期】This Week in Extracellular Vesicles 中第6条“特别关注”。
2. Identification of miRNA-enriched vesicles in bronchoalveolar lavage fluids: Insights into the function and heterogeneity of extracellular vesicles.
鉴定支气管肺泡灌洗液中富含miRNA的囊泡：洞察细胞外囊泡的功能和异质性。
[J Control Release] IF=7.877 PMID：30529727
摘要：尽管人们对细胞外囊泡（EV）中含有的微小RNA（EV-miRNA）的作用越来越感兴趣，但在病理生理条件下功能性EV-miRNA的存依然存在一定的质疑。由于EV的异质性，EV-miRNA研究相关的若干困难依旧阻碍着EV-miRNA的体内功能的研究发展。例如，据报道，特定的miRNA在外泌体中的含量可能小于每个外泌体一个拷贝。在这项研究中，我们证明了富含miRNA的EVs的存在，并且可以使用体内支气管肺泡灌洗液（BALF）通过差速离心和密度梯度分级来分离。这种'富含miRNA'的EV群体的绝对数量仅为每只小鼠约7.05×10^9（占总EV的6％）。然而，在该EV群体中检测到的RNA量占BALF中总EV RNA的约39％。相比之下，剩余的BALF EV群体（占总EV的76％）含有极低浓度的RNA和miRNA。 BALF中富含miRNA的EV可能来源于肺泡上皮I型细胞（ATI）。值得注意的是，caveolin-1，一种脂筏蛋白，仅在富含miRNA的EV中检测到，表明脂筏蛋白是EV-miRNA富集的潜在生物标志物。我们进一步证明ATI-EV中包含的miRNA被积极地递送到肺泡巨噬细胞中，随后在体外和体内促进炎性体激活，中性粒细胞募集和M1-巨噬细胞极化以响应铜绿假单胞菌肺炎。总的来说，我们是第一个识别和表征BALF中富含miRNA的EV的人。这些富含miRNA的EV支持细菌肺部感染中的促炎反应。我们的研究为肺病理学的生物标志物，治疗策略和潜在机制的发展提供了新的见解。
PS：细胞外囊泡中RNA的研究报道十分常见，但同时存在一些质疑声音，认为细胞外囊泡中miRNA的拷贝数很低，很多高表达水平的miRNA其实在细胞外囊泡中的拷贝数可能还不足1拷贝/囊泡。这些观测结果上的矛盾依旧还没有得到很好的解决。这篇文章一定程度上解释了这一问题。文章发现在细胞外囊泡的群体中可能存在着富含RNA和很少含RNA的不同亚群。
3. Essentials of extracellular vesicles: posters on basic and clinical aspects of extracellular vesicles.
细胞外囊泡的要点：细胞外囊泡的基础研究和临床应用相关海报。
[J Extracell Vesicles] PMID：30533205
摘要：过去十年见证了细胞外囊泡领域的飞速发展。 细胞外囊泡领域已经进入了从零星观察到系统研究的临界水平，科学界越来越多地认识到存在于所有体液中的这些亚细胞结构作为细胞分泌组的重要组分的潜在生物医学意义。国际细胞外囊泡学会制作了两张海报（“细胞外囊泡的基本方面”和“细胞外囊泡的临床方面”），为不熟悉该领域的人提供关于细胞外囊泡的重要信息。
PS：两张海报。介绍了细胞外囊泡领域最最最基本的一些知识点，顺便安利了一批ISEV成员们的网站数据库，大家可以随便看看。
4. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles.
基于大规模，交叉流动的高纯度的细胞外囊泡分离。
[J Extracell Vesicles] PMID：30533204
摘要：从细胞培养上清液或血浆中分离细胞外囊泡（EV）可以以多种方式完成。相对成功的常用量化措施包括：EV的浓度，非EV相关蛋白的纯度，最终产品的尺寸均匀性和功能性。在这里，我们提出了一种工业规模的细胞外囊泡分离方法。用于使用基于交叉流动的过滤和高分子量尺寸排除来分离高纯度和功能性的细胞外囊泡。通过这种组合，EV损失保持在最低水平。基于许多生化和生物物理分析证明这一方法优于其他分离程序。此外，通过该方法分离的EV可以进一步浓缩或直接免疫纯化以更为严谨的获得细胞外囊泡群体。根据我们的结果，我们提出交叉流过滤结合排阻层析是一种稳健的分离方法，可以从工业规模的输入体积中纯化高浓度，同质和功能活跃的EV，相对于其他方法几乎没有污染物。
PS：文章提出了一种工业级应用的细胞外囊泡分离纯化手段。具体未来的应用前景如何有待进一步应用确定。
5. Glioma exosomes mediate the expansion and function of myeloid-derived suppressor cells through microRNA-29a/Hbp1 and microRNA-92a/Prkar1a pathways.
胶质瘤外泌体通过microRNA-29a /Hbp1和microRNA-92a / Prkar1a途径介导髓样抑制细胞的扩增和功能。
[Int J Cancer] IF=7.36 PMID：30536597
摘要：髓源抑制细胞（MDSCs）在介导免疫抑制环境的形成和帮助肿瘤逃避宿主免疫应答中起关键作用。然而，肿瘤操纵MDSC的分化和功能的机制仍不清楚。在这里，我们研究发现缺氧诱导的胶质瘤细胞可以通过将外泌体miR-29a和miR-92a转移到MDSC来刺激功能性MDSC的分化。我们的研究结果表明胶质瘤衍生的外泌体（GEXs）可以在体外和体内增强功能性MDSCs的分化，并且缺氧诱导的GEXs（H-GEXs）表现出比常氧诱导的GEXs更强的MDSCs诱导能力（N- GEXs）。随后对N-GEX和H-GEX的miRNA测序分析显示，缺氧诱导的外泌体miR-29a和miR-92a表达诱导MDSC的繁殖。 miR-29a和miR-92a分别通过靶向高迁移率族转录因子1（Hbp1）和蛋白激酶cAMP依赖性I型调节亚基α（Prkar1a）激活MDSC的增殖和功能。总之，这项研究的结果提供了神经胶质瘤外泌体miRNA在介导肿瘤中免疫抑制微环境形成中的作用的新见解，并阐明了基于外源体miR-29a/ miR-92a的调控机制。
PS：MDSC是肿瘤组织中一种常见的浸润基质细胞，他们可以通过抑制宿主的免疫过程来帮助肿瘤进展。关于MDSC还存在一些争议，有人认为它们是一群为发育成熟的免疫细胞，也有人认为它们是被肿瘤特异性驯化的免疫细胞。这篇来自山东大学研究者们的报道介绍了胶质瘤细胞来源的外泌体通过miR-29a和miR-92a来影响MDSC的扩增和功能，从而促进肿瘤进展。
6. Graphene-oxide quenching-based molecular beacon imaging of exosome-mediated transfer of neurogenic miR-193a on microfluidic platform.
基于石墨烯 - 氧化猝灭分子信标成像外泌体介导神经源性miR-193a在微流体平台上的转移。
[Biosens Bioelectron] IF=8.173 PMID：30529896
摘要：基于石墨烯 - 氧化物（GO）猝灭的分子信标被开发用于快速和灵敏地检测活细胞和组织中的RNA。在这里，我们应用基于GO猝灭的分子信标传感器来可视化在微流体平台上的神经祖细胞中的细胞非自主神经发生期间通过外泌体递送的神经源性miR-193a水平。使用CD63-RFP质粒载体显现外泌体的转运，并设计用于miR-193序列的FAM标记的肽核酸（PNA）探针以检测内源miR-193表达。在二丁酰基-cAMP诱导的F11细胞中回收FAM-PNA193a-GO的荧光信号，这是由于神经元分化后miR-193a的表达增加所致。我们观察到从分化的供体F11细胞释放的含有miR-193a的外泌体向受体未分化的F11细胞的递送。在微流体系统中外泌体刺激的受体个体F11细胞中荧光恢复是明显的。我们提出使用PNA-GO复合物进行分子信标成像，以显示成熟microRNA的个体细胞表达。该系统揭示了成熟miRNA的精确空间定位和时间序列。
PS：细胞外囊泡来源的miRNA目前研究十分广泛，几乎涉及到常见的各种生理和病理过程。但是目前依旧没有有力的证据能够证明细胞外囊泡中的miRNA的命运过程。这主要是受限于技术手段的缺陷。这篇文章开发了用于miRNA检测的技术手段，相信未来在细胞外囊泡miRNA的追踪相关研究中具有一定的应用潜力。
7. Lithium-containing biomaterials stimulate bone marrow stromal cell-derived exosomal miR-130a secretion to promote angiogenesis.
含锂生物材料刺激骨髓基质细胞衍生的外泌体miR-130a分泌以促进血管生成。
[Biomaterials] IF=8.806 PMID：30529871
摘要：生物材料的化学信号可以在血管化骨再生过程中影响骨髓基质细胞（BMSCs） - 内皮细胞（ECs）的通讯。但是，潜在的机制仍然未知。外泌体，一种细胞外囊泡，最近已被证明是细胞 - 细胞通讯中潜在的旁分泌介质。然而，外泌体和外泌体微小RNA（miRNA）是否参与生物材料调节的BMSCs-ECs通信的化学信号是未知的。因此，在本研究中，我们应用模型Li掺入的生物活性玻璃陶瓷（Li-BGC）来探索生物材料介导的BMSC和EC之间的细胞 - 细胞通信的化学信号。我们的研究结果表明，Li-BGC在体外直接促进HUVECs的促血管生成能力和体内新生血管向内生长。此外，Li-BGC激活Wnt /β-catenin，AKT和NF-κB信号通路，而AKT信号通路可能作为Wnt /β-catenin和NF-κB信号通路的上游。更重要的是，Li-BGC通过在BMSCs衍生的外泌体中引发外泌体促血管生成miR-130a的表达，随后导致PTEN蛋白的下调和AKT途径的激活，最终导致在内皮细胞的增殖，迁移和管形成的增加，以及促血管生成基因的上调表达。我们的研究结果显示生物材料中的化学信号可能通过刺激骨重建的血管生成过程中的外泌体miR-130a分泌和PTEN / AKT信号通路，为生物材料的化学信号在BMSCs-ECs通讯中的调节作用提供新的见解。
PS：生物材料在体内引起的生物学反应可能来自多方面。因此评估生物材料对生物体的影响也是一个很好的研究方向。这篇文章着重研究了含锂的生物活性玻璃陶瓷对骨中血管生成的影响，主要研究了对BMSC和EC之间的通讯的影响。
8. Tumor-derived exosomal HMGB1 fosters hepatocellular carcinoma immune evasion by promoting TIM-1+ regulatory B cell expansion.
肿瘤来源的外泌体HMGB1通过促进TIM-1 +调节性B细胞扩增来促进肝细胞癌免疫逃避。 [J Immunother Cancer.] IF=8.374 PMID：30526680
摘要：调节性B（Breg）细胞是浸润入实体瘤并在不同肿瘤微环境中表现出不同表型的B细胞亚群之一。然而，Breg细胞在人肝细胞癌（HCC）中的表型，功能和临床相关性目前尚不清楚。我们进行流式细胞术分析确定了51例HCC患者样本中TIM-1 +Breg细胞的水平，表型和功能。使用对数秩检验产生总体存活和无病存活的Kaplan-Meier图。在体外分离，刺激和/或培养TIM-1 + Breg细胞和CD8+ T细胞用于功能测定。分离外泌体和B细胞并在体外培养用于TIM-1+ Breg细胞扩增测定。与成对的肿瘤周围组织相比，患有HCC的患者在其肿瘤组织中显示出显着更高的TIM-1 + Breg细胞浸润。浸润的TIM-1 + Breg细胞显示CD5highCD24-CD27 - / + CD38 + /表型，表达高水平的免疫抑制细胞因子IL-10并且表现出对CD8 + T细胞的强抑制活性。由肿瘤来源的外泌体激活的B细胞强烈表达TIM-1蛋白，并且具有对抗CD8 + T细胞的抑制活性，类似于从HCC肿瘤组织分离的TIM-1 + Breg细胞。此外，肿瘤中TIM-1 + Breg细胞的积累与晚期疾病阶段相关，预测HCC早期复发和HCC患者存活率降低。外源性HMGB1激活B细胞，通过Toll样受体（TLR）2/4和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路促进TIM-1 + Breg细胞扩增。我们的研究结果阐明了TIM-1 +的新机制。 Breg细胞介导的HCC免疫逃逸，并为使用这些新型外泌体通过HMGB1-TLR2 / 4-MAPK途径预防和治疗HCC的这种免疫耐受特征提供功能证据。
PS：文章介绍了Breg来源的外泌体如何调节免疫促进肿瘤细胞的免疫逃逸。
9. A potent immunomodulatory role of exosomes derived from mesenchymal stromal cells in preventing cGVHD.
源自间充质基质细胞的外泌体在预防cGVHD中的免疫调节作用。
[J Hematol Oncol] IF=7.333 PMID：30526632
摘要：间充质基质细胞（MSCs）由于其有效的免疫调节特性而适合于预防慢性移植物抗宿主病（cGVHD）疗法。然而，关于使用MSC的安全性问题仍未得到解决，并且由于MSC的异质性，现在一些研究的观察结果存在相互矛盾的地方。最近，外泌体被证明可介导MSCs的旁分泌作用，使其成为无细胞疗法的潜在候选者。本研究的目的是研究MSCs衍生的外泌体（MSCs-exo）在已建立的cGVHD小鼠模型中的功效和安全性。通过培养骨髓（BM）衍生的MSC，收集这些培养物的上清液以使用超速离心制备外泌体。来自人真皮成纤维细胞（Fib-exo）的外泌体用作阴性对照。建立cGVHD模型，每周一次施用尾静脉注射MSCs-exo或Fib-exo，持续6周。监测cGVHD的症状和体征，并通过染色检测组织病理学变化。通过流式细胞术，qPCR和Luminex评估MSC-exo对Th17，Th1和Treg的作用。此外，刺激人外周血单核细胞（PBMC）并在体外用MSCs-exo处理。通过流式细胞术，qPCR和ELISA评估表达IL-17的Th17和表达IL-10的Treg。我们发现MSCs-exo有效地延长了cGVHD小鼠的存活并减少了cGVHD的临床和病理评分。 MSCs-exo应用显着改善皮肤，肺和肝纤维化。在MSCs-exo处理的小鼠中，CD4 + T细胞的活化和它们向肺的浸润减少。值得注意的是，通过抑制表达IL-17的致病性T细胞和在cGVHD期间诱导表达IL-10的调节细胞，MSC-exo显示出有效的免疫调节作用。在MSCs-exo处理后，Th17细胞相关转录因子和促炎细胞因子的表达显着降低。在体外，MSCs-exo阻断Th17分化并改善从健康供体和具有活性cGVHD的患者获得的PBMC中的Treg表型，进一步表明MSC-exo对GVHD效应T细胞的调节作用。我们的数据表明，MSCs-exo可以通过抑制Th17细胞和诱导Treg来改善cGVHD的存活和改善病理损伤。该发现提供了用于治疗cGVHD的新的替代方法。
PS：移植物抗宿主病是移植失败的一大原因。MSC具有免疫调节作用，可以抑制移植物抗宿主病的强度，从而提高移植成功率，也有利于确保病人的生命安全。但是目前MSC的体内移植还存在着诸多问题。MSC来源的外泌体被大量的用于MSC疗法替代研究。这篇文章尝试了使用MSC来源外泌体来进行cGVHD的抑制，取得了一定的成功。
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