宏基因组测序在精准防控传染病中的应用

2019 年 7 月 12 日 转化医学网

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宏基因组学研究广泛应用于土壤、水体等环境样本，以及与人类疾病相关的微生物群落的生物多样性分析。此外，由于宏基因组学无需单独对病原分离培养，通过核酸提取纯化可以直接分析临床样本，其为传染病病原尤其是未知病原检测提供了新的技术手段和思路。

基于宏基因组学的二代测序(mNGS)可以得到样本中全部物种的基因组，从而能同时识别所有致病病原体，极大减少逐个排除可疑病原所耗费的时间及人力物力，并可对未知病原或已知变异较大病原进行识别，为传染病防控带来新的思路。目前，mNGS在公共卫生监测、病原检测以及传染病溯源等方面得到了广泛应用。

病原监测

采集某一地区或人群的临床样本、食品和媒介生物等各类样本进行宏基因组学测序，监测潜在致病病原，对可能出现的疫情进行预测预警，可有效预防突发公共卫生事件的发生。宏基因组测序能够克服传统方法的局限性，实现病原的高精度识别，为日常病原监测提供指导。

在一项研究中，研究者收集了24例季节性流感患者支气管肺泡灌洗液、痰液和咽拭子样本，实时定量PCR结果显示H3N2 和H1N1呈阳性，但不能进一步分型，通过宏基因组测序并与已报道的基因组比对，能精确其具体型别，而且在部分样本中发现其它病毒或细菌的混合感染。

随着全球化贸易的发展，病原借助于食品进行传播的风险加大，食品监测日益重要，但受限于检测范围，不能完全排除食物携带病原的可能性。研究者们通过对进口动物肉制品进行宏基因组测序，检测到冠状病毒、黄病毒、痘病毒、汉坦病毒等可能感染人类的病毒，表明其可能存在致病风险。

相同策略的宏基因组研究方法也可监测媒介生物，评估病原体感染人类的可能性，预防人畜共患病发生。为评估野生老鼠携带病毒对人类的致病风险，研究者采集了德国柏林地区 20只野生老鼠的肠道提取物样本并进行测序，检测到博卡病毒、沙波病毒、诺瓦克病毒和轮状病毒等多种病原，其中的轮状病毒株与人类致病密切相关。

病原检测

不明原因疾病和未知病原增加了临床诊断难度，无法进行有效治疗，导致患者病情加重甚至死亡。基于宏基因组学的测序在病原检测中发挥日益重要的作用。

几年前，德国暴发了急性肠出血性流行病，疫情初期没有特异性手段检测病原感染，而分离培养耗时长且比较困难。在对此次疫情进行回顾性研究中，研究人员采用宏基因组检测方法，采取40例疫情暴发期间的产志贺毒素型大肠杆菌（STEC）阳性粪便样本，并使用5例STEC阴性腹泻样本作为对照，未经分离培养直接提取DNA进行测序。在STEC阳性患者的样本中检测到该疾病的致病菌株 STEC O104∶H4，并且进一步检测到产志贺毒素的基因片段，在5例对照组中也检测到了艰难梭菌、空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的感染。这表明了宏基因组使用非培养样本检测病原体并分析其毒力的潜力。

2016年４月在安哥拉暴发了大规模的黄热病疫情。所报告的感染病例超过1700例，另外更有238例死亡病例。

黄热病此前从未在东亚或中国见诸报道。而在2016年3月，中国出现了首例输入性的黄热病。患者为在安哥拉务工并返回中国的中国籍劳务输入人员。

借助宏基因组测序技术，该病例血液样本在24小时内完成了全基因组测序工作，将相关测序读长进行组装和拼接，得到的一致性序列进行BLAST比对，结果与Angola71型毒株亲缘关系最近。随后的定量PCR回溯验证了测序结果。

病原溯源

在调查传染病疫情时，宏基因组学在对样本进行测序后，还可以对病原进行追溯，找到潜在传播途径，及时确定和切断感染源。

寨卡病毒通过蚊虫叮咬传播，孕妇感染后可导致新生儿小头症，2016 年寨卡病毒疫情暴发引起了广泛的关注。

研究者通过对两例孕妇患者的羊水样本直接进行高通量测序，检测到寨卡病毒的全基因组，表明寨卡病毒可以穿过胎盘屏障感染胎儿，随后利用PCR和ELISA验证检测结果，进一步全基因组系统发育分析显示其与法属波利尼西亚的寨卡病毒具有97-100%的相似度，这为建立寨卡病毒和小头症的联系及确定病毒来源提供了重要参考。

此外，研究人员发展了直接对临床样本测序的方法，通过多重PCR富集病毒基因组，并进行测序分析，可以得到病毒全部序列。基于上述方法，另一组研究团队获得感染患者的寨卡病毒序列，通过比对及溯源分析，发现该序列和北美地区埃及伊蚊中的病毒序列相似，推测病毒从危地马拉传入，并可能继续向北扩散，这为防止寨卡病毒进一步传播提供指导。据世界卫生组织报告，2017年和2018年寨卡病毒的发病率大幅下降。

利用宏基因组方法还可以对一些历史疫情或病例进行研究，从而对传染病病原进行时空溯源。一项研究收集了来自英国、丹麦、瑞典的距今1010-1383年共计22例骨骼和牙齿样本，使用宏基因组测序方法检测到麻风杆菌，并通过分析不同地区麻风杆菌的序列差异，探究麻风杆菌的起源与演变，推测美洲麻风病可能来源于欧洲，并且中东地区麻风杆菌基因型与中世纪欧洲地区基因型相关。

另外，在对一名1797年的木乃伊肺部残留组织样本提取核酸后进行测序后，发现其受到分布在欧洲和北美地区的两种不同基因型结核分枝杆菌的混合感染，这对研究结核分枝杆菌在世界范围内传播的过程具有重要意义。

高效控制新发传染病

张文宏团队利用宏基因组学方法，首次鉴定并治愈了猪疱疹病毒跨物种传播所致人类感染。这一成果源于华山医院感染科的一例病例。

2017年6月，华山医院感染科接诊了一名发热待查患者。追问病史，患者平日在养猪场工作，发病前一日被猪圈中的污水泼溅入双眼。考虑到人猪共患病所致中枢神经感染及眼内炎的可能，华山医院感染科送检术眼玻璃体液及脑脊液进行基于宏基因组学的二代测序 (mNGS)，以明确病原学诊断。

报告显示：患者脑脊液中未测得病原体，术眼玻璃体液中测出4832条猪疱疹病毒序列，覆盖度高达84%。但对于猪疱疹病毒这一以猪为自然宿主的病毒，在人类中随曾有疑似病例报道，但从无确诊病例。

结合患者的猪圈污染物接触史、眼内炎的临床表现及眼内手术标本测序结果，临床团队高度怀疑猪疱疹病毒感染，当即给予患者抗病毒治疗。

华山感染团队迅速分成三个团队分工合作。随后从基因学水平和免疫学水平同时鉴定猪疱疹病毒跨物种感染人病例的存在。多方证据协助临床确诊患者猪疱疹病毒感染，同时患者经过强化精准治疗获得病情缓解。

基于宏基因组学的二代测序 (mNGS)的不断发展，运用宏基因组学技术进行病原监测、检测和溯源，能够精准应对新突发传染病疫情，为公共卫生和疾病精准防控领域开辟了一条光明的通道。

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