《Nature》：又见张锋！CRISPR重磅突破：靶向RNA效果比肩诺奖研究！

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张锋

来源：学术经纬

2017年10月5日，知名华人学者张锋教授与他的团队在《自然》杂志上在线刊登了一篇论文，介绍了CRISPR系统的新应用——靶向哺乳动物细胞的RNA。这一应用能特异性抑制哺乳动物细胞中的基因转录产物，效果与2006年的诺贝尔奖研究“RNA干扰”并无明显区别。这一突破性的工具对基础科研有着重要意义。

说到CRISPR，许多人脑中的第一反应是CRISPR-Cas9基因编辑系统。的确，CRISPR技术改写了基因编辑的格局，但编辑DNA并不是它的全部作用。去年8月，张锋教授的课题组曾在《科学》上发文，指出一种叫做Cas13a（当时被称为C2c2）的蛋白与CRISPR进行组合，有望靶向RNA。今年4月，张锋教授团队的另一篇《科学》文章则表明，利用切割RNA的特性，CRISPR-Cas13a系统可以被改造成核酸检测工具，灵敏度可高达单分子！

▲“报告基因”系统的原理示意图（图片来源：《自然》）

研究人员们并没有就此停下脚步。Cas13a对RNA的切割能力有望让它成为基因研究中的重要工具，而我们需要确认的，是它在哺乳动物细胞内有没有应用的潜力。为了检验这个想法，研究人员们开发了一种“报告基因”系统。它带有编码两种荧光蛋白的基因，其中一条基因的RNA能被Cas13a识别和破坏，另一条则不受影响。如果Cas13a当真能在哺乳动物细胞内切割RNA，那么我们应该能预计，前一种荧光蛋白的含量会变低，而后一种荧光蛋白的含量不会出现明显变化。这正是研究人员所观察到的结果。

▲在Cas13a的作用下，被靶向的荧光蛋白水平（蓝色）显著下降，未被靶向的荧光蛋白水平（红色）则没有明显变化（图片来源：《自然》）

随后，研究人员们又探索了CRISPR-Cas13a系统对哺乳动物细胞内源基因的切割活性。他们选择了3条与癌症有关的基因KRAS、CXCR4、以及PPIB，并针对它们设计了CRISPR-Cas13a编辑系统。与外源的荧光蛋白一致，这3条内源基因的表达显著下降。换句话说，这个编辑系统对哺乳动物细胞的内源基因也同样有效。

更令人兴奋的是，研究人员还比较了RNA干扰在这三条基因上的抑制能力。RNA干扰技术曾于2006年斩获诺贝尔生理学或医学奖，在基础生物学或医学研究中有着极为广泛的应用。而本项研究表明，RNA干扰与CRISPR-Cas13a对这三条基因表达的抑制能力非常接近。换句话说，后者的抑制效果达到了诺贝尔奖研究的水平。

▲CRISPR-Cas13a系统（浅蓝）与RNA干扰（深蓝）的效果非常接近（图片来源：《自然》）

“RNA干扰与Cas13a系统的效果很相似。在有些时候，Cas13a的效果还要更好一些，”罗切斯特大学（University of Rochester）的Mitchell O’Connell教授对此赞誉有加：“在CRISPR技术诞生前，RNA干扰一直是调控基因表达的‘圣杯’。但使用Cas13a的一个好处在于，它的特异性更好。另外，它也不是哺乳动物细胞内自然形成的系统，对转录后调控网络的干扰风险也更低。”

在验证了有效性之后，研究人员们同样验证了这套系统的安全性。先前，这支团队发现Cas13a在细菌体内被激活后，会化身为非特异性的RNA酶，疯狂地切开遇到的所有RNA。这无疑是非常危险的。如果它在哺乳动物细胞内也陷入疯狂，就会破坏行使正常功能的RNA。严重时，这甚至可能导致细胞死亡。这样一来，它的应用也就无从谈起了。

▲在安全性上，CRISPR-Cas13a系统甚至要优于RNA干扰（图片来源：《自然》）

幸运的是，研究人员们的担忧并没有成为事实。Cas13a蛋白来源于一种叫做Leptotrichia wadei的微生物。或许是哺乳动物与它的演化关系过于遥远，这些Cas13a蛋白在哺乳动物细胞内非常安分守己，只切开特异的RNA，不影响其他RNA。

“这是本项工作的最大惊喜，”该论文的共同第一作者Omar Abudayyeh说道：“我们没有在哺乳动物细胞或是植物细胞中检测到任何Cas13a的额外活性。”

▲这一系统在追踪细胞内RNA的动态上还有额外的应用价值（图片来源：《自然》）

在靶向哺乳动物细胞内的RNA外，研究人员们还进一步拓展了这一技术。首先，他们表明在水稻原生质体（移除细胞壁的水稻细胞）中，CRISPR-Cas13a系统同样能靶向RNA。这表明这款工具在植物中同样有效；其次，他们还开发了一种失去酶活的Cas13a蛋白。它能结合RNA，但不会进行切割。研究人员们相信，在这些失活的Cas13a上添加荧光标记，就能追踪RNA在细胞内的移动，这也有着重要的应用价值。

自CRISPR技术诞生以来，张锋教授的实验室已经带给我们一个又一个惊喜。我们祝愿这名华人学者能走得更远，为科学带来更多CRISPR的应用。

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