科研人员在植物中实现A·T- G·C的单碱基替换

2月22日，中国科学院上海植物逆境生物学研究中心朱健康研究组的研究论文，以 Precise A·T to G·C base editing in the rice genome 为题，在线发表在 Molecular Plant 上。该研究报道了一种新型腺嘌呤碱基编辑器 ABE7-10 在水稻中的应用。它可以将水稻基因组特定位点的上 A·T 碱基对高效的转化为 G·C 碱基对。此研究扩展了植物中可用的单碱基编辑工具，并将进一步推动水稻等其他作物的分子精准育种。

碱基置换突变指一个碱基被另一个碱基取代，是最常见的突变形式。越来越多的研究表明，大部分生物性状的改变都存在着相关基因的突变，其中以碱基置换突变即点突变最为常见。寻求高效的单碱基编辑技术一直以来是植物研究的热点和难点。2017年10月，哈佛大学 David Liu 实验室在 Nature 上发表了题为 Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage 的研究论文，报道了一种新型的腺嘌呤碱基编辑器 ABE ，可以将基因组中特定位点的 A·T 碱基对高效的转化为 G·C 碱基对。该研究进一步扩展了目前基于 CRISPR/Cas9 的单碱基编辑工具。但 ABE 是以大肠杆菌 tRNA 腺嘌呤脱氨酶为基础，经过7轮的突变进化改造而得到的，虽然它能对哺乳动物细胞中的多个位点能够进行高效碱基编辑，但在植物中是否也可以高效利用尚不清楚。

基于哺乳动物细胞中已发表的结果，朱健康研究组在水稻中开发了一种新的腺嘌呤碱基编辑系统。研究人员合成了野生型 TadA 和其突变形式 TadA7-10 ，并将其用特定的街头连接到 Cas9（D10A）的 N 端，同时将 VirD2 的核定位信号肽（NLS）添加到 Cas9（D10A）的C末端，形成 ABEP1 腺嘌呤碱基编辑器。 ABEP1 在水稻中由玉米泛素启动子驱动表达。研究人员首先选择对水稻基因组中的 OsSPL14 和 SLR1 位点进行单碱基编辑，A·T 到 G·C 的替换的效率分别为26%和12.5%。为了证实该碱基编辑器能够同时对基因组多个靶位点同时进行编辑，研究设计了单个 sgRNA 同时靶向基因组中的多个位点。结果表明水稻基因组多个位点可以被 ABEP1 同时编辑。ABEP1 依赖于 SpCas9 识别靶位点，而 SpCas9 识别靶位点依赖于 NGG PAM 序列，这限制了水稻基因组中可被编辑的位点。为了进一步扩展水稻基因组中可被编辑的位点，研究设计 ABEP2 腺嘌呤碱基编辑器，其识别靶位点依赖于 SaCas9 。而 SaCas9 识别靶位点依赖于 NNGRRT PAM 序列。对水稻基因组的多个基因进行定点编辑表明 ABEP2 同样能够对目标位点进行高效的碱基替换，有些位点的效率高达61.3%。同时， ABEP2 可以对多个位点进行同时编辑。对所有的编辑位点测序后研究人员发现没有任何位点产生碱基插入、缺失或者其他形式的碱基替换，说明腺嘌呤碱基编辑器精确性很高。

结合研究组此前开发的基于 APOBEC1 酶的碱基编辑器，可以在水稻基因组中实现对 DNA 四种不同碱基的高效替换（A-G, T-C, C-T, G-A）。这将进一步推动水稻功能基因组研究，并对作物分子精准育种产生重大影响。

抗逆中心博士研究生华凯为论文第一作者，研究员朱健康为通讯作者。生物技术平台为该研究提供了技术支持，研究工作得到中科院的资助。

A.水稻中两种腺嘌呤碱基编辑器的载体示意图。B.OsSPL14中的靶位点示意图，miR156 结合位点由红色字体标出。C.两株代表性的转基因植株的测序峰图，黑色箭头指示出编辑位点。D.不同 sgRNA 编辑效率的统计信息

来源：中国科学院上海生命科学研究院